شناسایی و رده بندی مولکولی عوامل فایتوپلاسمایی گیاهان علوفه ای(شبدر،یونجه و اسپرس)در منطقه مرکزی ایران

فایتوپلاسماها یک تهدید مهم برای کشت گونه های گیاهی مهم به شمار می روند و باعث ایجاد 700 بیماری در گیاهان مهم اقتصادی مانند درختان میوه، گیاهان علوفه ای، زینتی، سبزی و نیز میزبانان وحشی می گردند. در استان اصفهان نیز بیماریهای فایتوپلاسمایی گسترش قابل توجهی پیدا کرده اند و آلودگی شدیدی به بیماریهای فایتوپلاسمایی در گیاهان علوفه ای وجود دارد. گیاهان مبتلا علایم زردی، ریزبرگی، کوتولگی و جاروی جادوگر نشان می دهند و وقوع خسارت در مزارع منطقه رو به ازدیاد است. به دلیل اینکه در این منطقه بیماریهای فایتوپلاسماهای مختلفی در روی محصولات متفاوت شایع هست و دامنه میزبانی این فایتوپلاسماها به گیاهان لگومینوز نیز گسترش پیدا کرده است، بنابراین در تحقیق حاضر شناسایی و گروه بندی فایتوپلاسماهای آلوده کننده گیاهان علوفه ای در اصفهان مورد توجه قرار گرفت. به این منظور طی سالهای 88- 1387 از گیاهان یونجه، شبدر و اسپرس دارای علایم زردی، ریزبرگی و کم رشدی در مناطق مختلف اصفهان نمونه برداری شد. در اکثر موارد به دلیل پایین بودن غلظت فایتوپلاسما، طی انجام واکنش pcr دور اول هیچ باندی مشاهده نشد، ولی در nested-pcr با استفاده از جفت آغازگر p1/p7 در واکنش pcr اول و r16f2n/r16r2 در واکنش pcr دوم، قطعه مورد انتظار حدود 1239 نوکلئوتیدی ناحیه 16s rdna فایتوپلاسمایی در 57 گیاه آلوده تکثیر شد. ردیابی قطعه dna مورد نظر فایتوپلاسمایی در بوته های یونجه، شبدر و اسپرس دارای علایم فایتوپلاسمایی و عدم تکثیر این قطعه dna در گیاه سالم نشان داد که عوامل فایتوپلاسمایی در ایجاد این بیماری ها در مزارع گیاهان مورد بررسی نقش دارند. به منظور شناسایی جدایه های فایتوپلاسمایی در نمونه های جمع آوری شده از مناطق مختلف از آزمون pcr-rflp استفاده شد. به این منظور قطعه تکثیر شده 1239 نوکلئوتیدی طی واکنش nested-pcr توسط آنزیمهای محدودگر cfoi، msei، kpni، rsai، taqi، alui، haeiii، sau96i برش داده شد. مقایسه الگوی rflp این قطعات با فایتوپلاسماهای شناخته شده مورد استفاده در این تحقیق نشان داد که اکثر این نمونه ها آلوده به فایتوپلاسماهای candidatus phytoplasma solani (گروه 1) و ca. phytoplasma aurantifolia (گروه 2) می باشند. تعداد محدودی از نمونه ها نیز الگوی برشی متفاوتی داشتند که در گروه 3 قرار گرفتند. ترادفهای نوکلئوتیدی قطعه حدود 1239 نوکلئوتیدی ناحیه 16s rdna چهار نمونه از هرگروه نشان داد که در مطابقت با نتایج حاصل از pcr-rflp، جدایه های فایتوپلاسمایی گروه 1 شباهت بسیار زیادی (99%) باتوالی فایتوپلاسماهای ca. phytoplasma solani دارند و جدایه های مربوط به گروه دوم نیز متعلق به گروه ca. phytoplasma aurantifolia می باشند. با تعیین توالی نوکلئوتیدی جدایه های گروه 3 مربوط به آزمون rflpمشخص گردید که تعدادی از این جدایه ها متعلق به گروه aurantifolia ca. phytoplasma هستند، ولی اکثریت آنها به ca. phytoplasma solani شباهت دارند. نکته قابل توجه در بررسی این نمونه ها، مغایرت نتایج توالی یابی با نتایج pcr-rflp در طبقه بندی جدایه های مربوط به گروه 3 بود که معلوم شد جدایه های دو فایتوپلاسمای غالب منطقه علیرغم شباهتهای زیاد، تفاوتهایی نیز از نظر محل برشهای آنزیمی دارند. از این نتایج چنین استنباط شد که pcr-rflp روش دقیقی برای طبقه بندی فایتوپلاسماها نیست و برای تعیین گروه های فایتوپلاسمایی ضروری است که توالی ژنهای حفاظت شده آنها با توالی فایتوپلاسماهای شناخته شده مقایسه گردد. بر اساس نتایج بدست آمده مشخص گردید که فایتوپلاسمای ca. phytoplasma solani شایعترین فایتوپلاسمای مزارع یونجه، شبدر و اسپرس در استان اصفهان است و اهمیت شیوع ca. phytoplasma aurantifolia در مراحل بعدی قرار دارد. در این پژوهش ارتباط معنی داری بین میزان آلودگی فایتوپلاسمایی و میزبان مربوطه و یا ناحیه جغرافیایی بدست نیامد. نتایج حاصل از تعیین فون زنجرک های مزارع مختلف گیاهان علوفه ای مبتلا به بیماریهای فایتوپلاسمایی نشان داد که گونه های متفاوتی از زنجرکهای ناقل فایتوپلاسما در این مزارع حضور دارند. در این تحقیق، رابطه مشخصی بین فراوانی جمعیت زنجرک ها با میزان وقوع آلودگی های فایتوپلاسمایی در مزارع بدست نیامد.